Il fiume nasce a 548 m s.l.m. in località Fornaci della Riana alla Rasa di Varese, presso il Sacro Monte di Varese, all'interno del Parco regionale Campo dei Fiori.

Solcata la Valle Olona e attraversato l'Alto Milanese, l'Olona giunge a Rho, dove versa parte delle sue acque nel Canale Scolmatore di Nord Ovest. Passata Pero, il fiume entra a Milano, dove, all'uscita del suo percorso sotterraneo, confluisce nel Lambro Meridionale in località San Cristoforo ponendo fine al suo corso. Il Lambro Meridionale sfocia poi nel Lambro a Sant'Angelo Lodigiano. Lungo il suo percorso, il sistema idrico formato dall'Olona e dal Lambro Meridionale attraversa o lambisce 45 comuni ricevendo le acque di 19 affluenti.

L'Olona è noto per le cascate e le grotte di Valganna e per essere stato uno dei fiumi più inquinati d'Italia. La valle scavata dal fiume, grazie all'impianto di ruote idrauliche che sfruttavano la forza motrice originata dall'acqua, è stata una delle culle dell'industrializzazione italiana.

Il fiume talvolta è indicato anche come "Olona settentrionale" per l'omonimia con un altro Olona, che nasce a Bornasco e che sfocia nel Po dopo aver attraversato la provincia di Pavia. Questo secondo Olona, a sua volta, viene designato come "inferiore" o "meridionale". L'omonimia non è di origine imitativa o etimologica, ma è dovuta al fatto che originariamente si trattava di due tronconi dello stesso fiume, deviato dagli antichi Romani nel suo tratto superiore verso Milano per portare acqua al fossato delle mura difensive della città.